1 、 蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理 ， 已知的结合力包括疏水作用力\H键\静电作用力等 ，确切的结合原理并不明确 ，主要靠假说来支撑 。主要有两种假说:
（1） 首先两者靠静电作用力结合 ， 然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合 。
（2） 首先两者靠疏水作用结合 ， 然后靠静电作用来维持长时间结合 。
两条假说 ， 都表明其结合过程分为两步 ， 首先结合和后面长时间结合 。由于结合原理的不明确性 ， 导致在这方面的工作非常依赖实践经验 。
2 、 膜对结合的影响
（1）膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜 ，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品 ，如果是不同厂家的产品 ，这种比较是无意义的 。膜孔径与层析速度的关系 ，已在上文描述 。
随着膜孔径减小 ，膜的实际可用表面积递增 ，膜结合蛋白的量也递增 。估量表面积的参数为表面积比率(实际可用表面积与所用膜平面积的比率) 。
另外 ， 膜孔径越小 ，层析速度也越小 ，那么金标复合物通过T线的时间也就越长 ，反应也就越充分 。
综合以上两点 ，结论为膜孔径越小灵敏度越高 。但是同时也减慢了跑板速度 ，增加了非特异性结合的机会 ，也就是假阳性越高 。所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜 ，找到合适的平衡点 。
（2）不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点 ：
A 、生产膜时 ，使用的聚合物和表面活性剂的来源 ，类型 ，数量不同 。同理 ，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响 。
B 、处理过程不同 。
3 、 生物原料 ，缓冲溶液的试剂和配方
（1）生物原料
作为CT线的生物原料使用情况各异 ，所以这里只做略述 。
首先 ，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体 ， 主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点 ， 而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别 ， 毫无疑问就增加了优化难度 。
其次 ，分子量越大 ，蛋白越难结合到固相材料上 。
（2）缓冲液
大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方 ，包括缓冲液 ，封闭液等等处理溶液配方 。
其实我也无法提供给你一个万用配方清单 。因为不同的反应体系需要不同的配方来支持 ， 而不同机构的反应体系又有差异 。想获”鱼”先学”渔” 。为了不误导大家 ，我在下面涉及到配方的问题上 ，仅提供思路 ，具体配方请自己摸索 。
缓冲液的构成一般是: PBS(或其他缓冲体系)+作用物质(针对某一特定问题)+PH调整 。我在参考过以前的各种资料后 ，个人意见为配方原则为宜简不宜繁 ，根据自己的需要添加作用物质 ，原来的很多需要添加的作用物质 ，由于膜制造技术的改进已经不再需要 。
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2, 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性 。
作用物质的情况大致罗列如下:
少量NACL,减少信号强度 ，消假阳 。
有机醇(甲醇 ，异丙醇等) ，润湿膜 ，减少膜带有的静电 ，利于结合包被 。个人不推荐 ，因制膜工艺改进 。
表面活性剂(TW20,TX100) ，增加亲水力 ，可避免线条中空现象 ，也可增色 。
糖保护剂 ，减缓老化速度 ，也可以增加亲水力同上 。
调PH到某个位置 ，可以消假阳 。
4 、 点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要 。最佳湿度一般在45-65% 。
湿度过低 ，膜上容易聚集静电荷 ，点膜容易出现散点 ，导致测试会出现疏水斑 。
湿度过高 ，膜上毛细作用加强 ，点膜容易引起CT线变宽甚至扩散 。
为了保证点样时膜湿度的均一性 ，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间 。
5 、 点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式 ，划膜式和非接触点膜式 。非接触点膜式优于划膜式 ，进口划膜式优于国产划膜式 。
因划膜式为软管将抗体划到膜表面 ，而膜本身的物理性质为软脆 ，划管会在其表面留下印痕 。进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好 ，所以留下的划痕较轻 ，而国产仪器较差 ，留下的划痕也就比较严重 。划痕容易对层析的金标复合物形成阻力 ，导致假阳性 。同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线(鬼线) ，而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象 。
6 、 膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18mm(or 20mm)和25mm两种 ， 分别使用在做测试条和做测试板上 。
然而 ，不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度 。点样位置上移 ，金标复合物通过T线位置时速度变慢 ，反应时间增加 ，灵敏度升高 。反之灵敏度降低 。这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性 。
7 、 溶液在膜上的扩散
溶液在膜上的点样量一般情况下为1ul/cm.
溶液在膜上的扩散是趋向两端的 ，喷点上去的是均匀的抗体溶液 ，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间 ，中间的抗体会不断向两边扩散 ，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的 。一般情况下不影响你的试验 。如果你发现线条出现两端红 ，中间淡的现象 ，就要考虑这个问题了 。可以加如上面说的作用物质来解决 。
8 、 点膜前后的封闭作用
从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的 ，直接点膜就可使用 。然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论 。
其实封闭不象大家认为的那样 ，一封闭什么问题都解决了 。老问题走了新问题又来了 ，而且更麻烦 ，我要说的是慎用封闭 。
我极其反对点膜前封闭的做法 。原因为厂家在生产膜时候 ，各种配方是混合加入原浆的 。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内 ，必然扰乱了膜内正常的物质分布 。由此引发了许多问题 ，也降低了工作效率 。也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题 ，其实可以通过其他办法来解决 ，封闭必然是下测 。
我经常使用的封闭手法有两种 。
流动封闭 ，将作用物质处理在样品垫上 。
膜上定点封闭 ，将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上 。该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头 。可以将不合格的半成品大板重新复活 。
只要是将封闭做在了膜上 ，就必然会对产品的稳定性造成影响 。具体的影响程度要通过稳定性测试来评判 。
9 、 膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分 。关于膜的老化机理 ，有个理论支持 ，不过争议比较大 。理论认为:膜的老化是因为膜上的水分蒸发 ，使膜变得疏水 ，带电荷并变脆 。储存膜一般要求是避光 ，密封 。过干或过湿都不利 。在这种保存条件下 ，一般可以放置两年 。但是如果膜上做了封闭处理 ，就要根据具体试验情况来判断了 。
有些膜由于生产工艺的问题 ，使用后灵敏度会在一段时间内发生变化 ，遇到这种问题 ，就需要在点膜后放置一段时间 ，待稳定后方可进入调试生产 。
